Restriktionsenzyme
Die Cas-Proteine sind ein wesentlicher Bestandteil des CRISPR-Cas-Werkzeuges. Sie gehören zu den Restriktionsenzymen. Restriktionsenzyme sind Enzyme, die DNA an einer spezifischen Stelle erkennen und schneiden.
In der Natur kommen die Restriktionsenzyme in Bakterien vor. Wie z.B. Cas9, dienen diese Enzyme den Bakterien als Verteidigung gegen Viren. Die Fremd-DNA wird an einer spezifischen Basensequenz zerschnitten, damit sich die Eindringlinge nicht weiter vermehren können. Aufgrund dieser Restriktion, also der Einschränkung der Fortpflanzung von Viren, haben die Enzyme den Namen Restriktionsenzyme erhalten. Zum Schutz vor den eigenen Restriktionsenzymen, wird die Bakterien-DNA verändert. Dabei werden die Erkennungssequenzen meist methyliert, sodass eine Spaltung der eigenen DNA verhindert wird.
Es sind über 100 Restriktionsenzyme bekannt. Jedes Restriktionsenzym hat eine eigene Erkennungssequenz. Nur eine bestimmte Basenabfolge wird von den Enzymen erkannt und geschnitten. Diese Eigenschaft ist mit der Funktionsweise von Enzymen zu erklären, denn Restriktionsenzyme sind wie alle Enzyme substrat- und wirkungsspezifisch.
Enzyme sind Biokatalysatoren. Katalysatoren erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeit chemischer Reaktionen, in dem sie die Aktivierungsenergie herabsetzen. Damit die zahlreichen chemischen Vorgänge in unserem Körper in kurzer Zeit und bei niedriger Temperatur ablaufen können, werden Enzyme benötigt. Enzyme haben die Funktion, sämtliche Reaktionen in unserem Körper zu beschleunigen. Jeder chemischen Reaktion muss zunächst Energie z.B. in Form von Wärme zugeführt werden, damit sie ablaufen kann. Diese zugeführte Energie wird als Aktivierungsenergie bezeichnet, da sie notwendig ist, um eine chemische Reaktion in Gang zu bringen. Enzyme setzen die Aktivierungsenergie herab, da sie einen anderen Reaktionsweg mit einer geringeren Aktivierungsenergie bereitstellen.
Um die Aktivierungsenergie herabzusetzen, wird ein Enzym-Substrat-Komplex gebildet. Das Substrat ist der Ausgangsstoff, der in einer katalysierten Reaktion durch das Enzym zu den Produkten umgesetzt wird. Im aktiven Zentrum wird das Substrat an das Enzym gebunden. Dies erfolgt nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip. In die spezifische Passform des aktiven Zentrums passt nur ein bestimmtes Substrat. Enzyme sind substratspezifisch, da meist keine anderen Moleküle an das aktive Zentrum binden können. Das Substrat wird zu den Produkten umgesetzt und das Enzym steht erneut für weitere Substrate zur Verfügung. Enzyme setzen ein bestimmtes Substrat um, weshalb sie nur eine spezifische Reaktion katalysieren. Enzyme sind wirkungsspezifisch, da aufgrund des Schlüssel-Schloss-Prinzipes nur eine von mehreren Reaktionen des Substrates katalysiert wird.
Restriktionsenzyme sind substrat- und wirkungsspezifisch, da sie nur an eine bestimmte Erkennungssequenz binden, um die DNA an dieser Stelle zu schneiden. Die Cas-Proteine schneiden sequenzspezifisch, da die molekulare Genschere an eine Leit-RNA bindet, mit der sie gezielt zu der gewünschten Stelle im Genom geleitet wird. Dort bindet die Genschere an die bestimmte DNA-Sequenz. Die Zucker-Phosphat-Bindungen der beiden DNA-Stränge werden vom Enzym gespalten.
Die Spaltung der Erkennungssequenz kann unterschiedlich ablaufen. Werden die DNA-Stränge an der gleichen Stelle geschnitten, entstehen sogenannte „blunt ends“, glatte Enden. Der DNA-Doppelstrang wird also an sich gegenüberliegenden Stellen geschnitten. Wird der DNA-Doppelstrang um einige Basenpaare versetzt geschnitten, entstehen sogenannte „sticky ends“, klebrige Enden. Die Überhänge werden klebrige Enden genannt, weil die einzelsträngigen Enden zueinander komplementär sind und sich aufgrund der Basenpaarung erneut verbinden können. Die überlappenden Enden können auch mit jeder beliebigen komplementären Sequenz verbunden werden. Dadurch bieten sie die Möglichkeit, DNA-Sequenzen unterschiedlicher Herkunft miteinander zu verknüpfen und somit das Erbmaterial genetisch zu verändern.
Neben den Restriktionsenzymen spielen beim Gendoping jede Menge andere Enzyme eine wichtige Rolle, denn ohne sie könnte die DNA nicht gezielt verändert werden.
Um z.B. die klebrigen Enden bei der DNA-Spaltung zu verbinden, werden die DNA-Ligasen benötigt. Die komplementären Enden werden mithilfe der DNA-Ligase erneut zu einem DNA-Doppelstrang verbunden. Sie sind ein wichtiger Bestandteil des natürlichen Reparaturmechanismus, denn das fehlerhafte Verbinden oder das Verbinden mit anderen DNA-Sequenzen spielt beim CRISPR-Cas-System eine zentrale Rolle.
Die Zucker-Phosphat-Bindungen der beiden DNA-Stränge werden mit Hydrolasen gespalten. Diese Enzyme spalten DNA und RNA durch Hydrolyse, dem Spalten einer chemischen Bindung durch die Umsetzung eines Wassermoleküls. Das Enzym DNAse katalysiert z.B. die Spaltung der Zucker-Phosphat-Bindung bei der DNA.
Die Funktion von Enzymen, chemische Bindungen zu lockern, Substrate an das aktive Zentrum zu binden und umzusetzen, ist auf die Struktur der Enzyme zurückzuführen. Enzyme sind Proteine, die zwischenmolekulare Kräfte besitzen und Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden.
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Proteine bestehen aus Aminosäuren, die durch Peptidbindungen miteinander verknüpft werden. Dabei reagiert die Carboxylgruppe (COOH) der einen Aminosäure mit der Aminogruppe (NH 2) der anderen Aminosäure. Unter Wasserabspaltung entsteht eine Peptidbindung. Ein Molekül aus über 100 Aminosäuren, das für biologische Funktionen verantwortlich ist, wird Protein genannt.
Bei Proteinen wird zwischen verschiedenen Strukturen unterschieden. Als Primärstruktur wird die Reihenfolge der Aminosäuresequenzen, die durch Peptidbindungen verbunden sind, bezeichnet.
Bei der Sekundärstruktur ordnen sich die Aminosäuresequenzen in einigen Bereichen dreidimensional an. Es werden alpha-Helices und beta-Faltstrukturen gebildet. In einer alpha-Helix ist das Molekül schraubenförmig um seine Längsachse gewendet. Zahlreiche Wasserstoffbrückenbindungen sorgen für Stabilität. Sie entstehen zwischen den jeweiligen Peptidbindungen. In einer beta-Faltstruktur kann es zu vielen verschiedenen Anordnungen kommen. Sie können spiralförmige Strukturen ausbilden, die durch Schlaufen verbunden sind. Die sich wiederholenden Wasserstoffbrückenbindungen sorgen dabei ebenfalls für die stabile Struktur.
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Die Tertiärstruktur bezeichnet die vollständige dreidimensionale Anordnung der Aminosäuresequenzen. Es bildet sich ein Makromolekül, ein sehr großes Molekül, dass durch die zwischenmolekularen Kräfte zusammengehalten wird. Im Molekülinneren herrschen vermehrt Van-der-Waals-Kräfte. Zusätzlich werden Wasserstoffbrückenbindungen ausgebildet. Zudem können Ionenbindungen zwischen funktionellen Gruppen entstehen. Gibt die Carboxylgruppe ein Proton ab, ist sie negativ geladen (COO -). Aminogruppen nehmen gerne ein Proton auf, wodurch sie positiv geladen sind (NH 3+). Die beiden entgegengesetzt geladenen Seitenketten ziehen sich an, es entsteht eine Ionenbindung. Es können auch Disulfidbrücken ausgebildet werden. Besitzen zwei benachbarte Seitenketten eine SH-Gruppe, bildet sich unter Abspaltung des H-Atoms eine Disulfidbrücke (S-S).
In der Quartärstruktur haben sich mehrere Aminosäureketten zu einem Komplex zusammengefügt, wobei dieser wie bei der Tertiärstruktur chemisch zusammengehalten wird.
Die chemische Struktur ist für alle Funktionsweisen und Aktivitäten der Enzyme maßgebend. Aufgrund der zwischenmolekularen Kräfte können Proteine ihre räumliche Struktur ändern, um verschiedene Funktionen auszuführen. Die Cas-Proteine ändern ihre chemische Struktur, um an die Leit-RNA zu binden. Nach der Wahrnehmung der Ziel-Sequenz können die Ziel-DNA-Stränge durch eine weitere Strukturänderung des Enzyms gespalten werden. Außerdem aktivieren die Cas-Proteine verschiedene andere Enzyme, deren Eigenschaften ebenfalls auf die chemische Struktur aufbauen.