Der Weg in die Zelle – Vektoren
Vektoren transportieren Gene in die Zellen. Damit die therapeutischen Gene bei der Gentherapie, sowie das CRISPR-Cas-Werkzeug aus RNA-Molekülen und einem Cas-Protein in die Ziel-Zellen gelangen, werden Vektoren benötigt. Sie werden auch Genfähren genannt. Es gibt viele verschiedene Genfähren. Es werden virale von nicht-viralen Vektoren unterschieden.
Die viralen Vektoren sind bisher am weitesten entwickelt und wurden in klinischen Studien der Gentherapie eingesetzt. Viren schleusen von Natur aus ihre Gene in die Zellen ihres Wirtes. Im Labor müssen die Viren genetisch verändert werden, sodass sie nicht mehr ihre eigenen Gene mitführen, sondern die Gene, die in die Zellen des Patienten transportiert werden sollen. Zusätzlich werden die Viren weitestgehend so verändert, dass sie sich im Körper nicht unkontrolliert vermehren oder Krankheiten verursachen. Zu den viralen Vektoren gehören unter anderem Adenoviren, Retroviren oder AAV-Systeme.
Adenoviren enthalten in ihrem Kapsid eine doppelsträngige, lineare DNA, die im Labor einfach zu verändern ist. Die manipulierten Adenoviren werden zahlreich vermehrt und dem Patienten injiziert. Der Gentransfer mit Adenoviren bei Jesse Gelsinger 1999 zeigt die Gefahr viraler Vektoren. Sein Körper zeigte eine starke Immunreaktion, die er nicht überlebte.
Retroviren besitzen in ihrem Kapsid zwei einzelsträngige RNA-Moleküle. Die angepassten RNA-Moleküle werden in die Zelle eingeführt. Mithilfe von Enzymen wird aus den RNA-Molekülen eine doppelsträngige DNA, die in den Zellkern gelangt. Diese wird im Genom eingebaut, wodurch die Zelle genetisch verändert wurde. Die Genmanipulation mit Retroviren sorgt für eine langanhaltende Wirkung. Jedoch können Retroviren nur bei teilungsfähigen Zellen eingesetzt werden und ihre Erbsubstanz wird nicht immer in die gewünschten Ziel-Zellen eingebaut.
AAV-Systeme beinhalten Adeno-Assoziierte-Viren. Diese Viren besitzen in ihrem Kapsid eine einzelsträngige DNA, dessen schlichte Struktur leicht zu verändern ist. Aufgrund ihrer begrenzten Struktur, sind AAV-Systeme auf Helferviren angewiesen, die die fehlenden Gene beinhalten. Zum Beispiel können Plasmide als Helfervirus dienen, womit ein Vektor aus viralen und bakteriellen Sequenzen kombiniert wurde. AAV-Systeme scheinen für die Zukunft vielversprechend zu sein. Sie sind sehr effizient, da sie bis zu 96 % des Genoms durch andere DNA ersetzen können. Zudem rufen sie eine geringe Immunreaktion hervor und bauen ihre DNA mithilfe einer komplementären Sequenz, bei CRISPR-Cas mithilfe der Leit-RNA, fast zielgenau an die gewünschte Stelle im Genom ein.
Mit der Zeit setzten sich auch die risikoärmeren nicht-viralen Vektoren durch. Dazu gehören unter anderem die Injektion nackter DNA, Plasmide oder Lipoplexe.
Bei der Injektion nackter DNA wird die DNA in Reinform z.B. mit einer Mikroinjektion direkt in die Zelle injiziert. Bei einer Mikroinjektion wird die DNA mit Glaskapillaren oder feinen Hohlnadeln in die Zelle eingebracht. Die Fremd-DNA kann auch durch Elektroporation eingeschleust werden. Dabei wird für kurze Zeit eine hohe Spannung angelegt, die kleine Poren in der Zellmembran verursacht, durch welche die DNA transportiert wird. Beim Partikelbeschuss wird die Fremd-DNA um winzige Goldpartikel gehüllt, die dann in den Zellkern geschossen werden. Dies passiert ex vivo im Labor, wobei neben der Fremd-DNA ein Selektionsmarker injiziert wird. Durch den Selektionsmarker werden die Zellen markiert, die erfolgreich die Fremd-DNA in ihr Genom eingebaut haben und in den Körper eingebracht werden können. Jedoch werden nur eine geringe Anzahl der Zellen erfolgreich behandelt und eine erfolgreiche Injektion hat häufig keine dauerhafte Wirkung.
Plasmide sind bakteriellen Ursprungs und bestehen aus einem doppelsträngigen, meist ringförmigen DNA-Molekül. Sie gehören zu den vielversprechendsten Vektoren, denn sie haben sich in klinischen Studien bereits bewährt und sie lassen sich technisch einfach konstruieren. Beim ex vivo Gentransfer bauen nicht alle Plasmide die Fremd-DNA in ihre Struktur ein. Die unveränderten und genetisch veränderten Plasmide werden zu einer Zellkultur gegeben. Die Zellen, die ein genetisch verändertes Plasmid aufgenommen haben, werden ausgewählt. Dazu dienen Markergene oder Selektionsmarker, die eine erfolgreiche Übertragung, also Plasmide mit einer Fremd-DNA, erkennen. Damit die Plasmide die entsprechenden Ziel-Zellen finden, werden die Fremd-DNA und eine komplementäre DNA zur Zielsequenz mit mehreren Enzymen chemisch verknüpft. Bei CRISPR-Cas entspricht dies der Leit-RNA. Die Leit-RNA und Cas9 werden von den Plasmiden verschlüsselt. Jedes Plasmid besitzt einen Replikationsursprung. Diese Sequenz enthält Schnittstellen für verschiedene Restriktionsenzyme.
Liposome, im Gentransfer Lipoplexe genannt, sind kleinste Fetttröpfchen, in die die Fremd-DNA eingebaut wird. Durch die Lipiddoppelschicht gelangen die Lipoplexe durch die Zellmembran und können durch die Blutlaufbahn zu den Ziel-Zellen gelangen. Das CRISPR-Cas-Werkzeug kann effizient in die Liposomen eingeführt werden. Aufgrund bestimmter Rezeptormoleküle docken die Lipoplexe an die gewünschten Ziel-Zellen und der CRISPR-Cas-Komplex wird in die Zelle geschleust.